本发明属于甾体激素药物分析方法领域，特别涉及一种雌酚酮有关物质的HPLC分析方法，主要参数包括：选用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；采用流动相梯度洗脱，流动相的组成为水、甲醇及乙腈；在适当流速和柱温下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。本发明能有效的洗脱、分离和定量雌酚酮原料药中的杂质，使杂质峰与主峰完全分离，且分析速度快，同时该方法也可单独适用于雌酚酮杂质A样品或杂质D样品的有关物质检测。