本发明公开了一种口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用，本发明的制备方法首先用硫酸鱼精蛋白沉淀去除大部分宿主细胞杂蛋白和核酸；然后病毒液经浓缩系统浓缩后作为层析上样样品。层析介质选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶进行纯化洗脱，收集第一个洗脱峰，过滤除菌后灭活，加入佐剂进行乳化，分装即得口蹄疫纯化疫苗。本发明的制备方法经济高效、且成本低，工艺简单、合理，能有效去除宿主细胞和培养基中的杂质，病毒回收率大于85％，蛋白和核酸去除率大于90％，由本发明方法制备得到的口蹄疫纯化疫苗安全，免疫性好、性质稳定。