本发明公开了一种检测复方三维右旋泛酸钙糖浆4种B族维生素含量的方法，以乙腈为流动相A相，以含十二烷基硫酸钠的甲酸水溶液为流动相B相；取待测溶液进行HPLC检测后，根据色谱图对维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺4种维生素进行定性和/或定量分析；所述HPLC检测过程中采用梯度洗脱。与现有技术相比，本发明通过HPLC法实现快速定性鉴定和/或定量检测复方三维右旋泛酸钙糖浆中4种维生素，为复方三维右旋泛酸钙糖浆开发利用和质量评价提供了可靠的实验依据。