本发明涉及一种木糖母液的色谱分级提纯方法，先对木糖母液进行预处理，然后将进行一级色谱分离分别得到一级提取液和一级提余液，一级提取液加工成木糖晶体，一级提余液则经过浓缩后再进行二级色谱分离分别得到二级提取液和二级提余液，二级提取液经过浓缩后返回再进行一级色谱分离提纯，二级提余液则被加工成副产品外售。本发明通过色谱分离技术，对木糖母液进行分级提纯，从而降低了木糖母液的分离难度，提高了木糖回收率。