本发明属于发酵乳领域，具体公开了一种罗伊氏乳杆菌常温酸奶及其制备方法，该方法首次采用后添加的方式将罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）CGMCC NO.25389添加入酸奶基料中，制备得到含有罗伊氏乳杆菌活菌的酸奶，该酸奶在25℃常温保藏6个月后，活菌数高，质地稳定，依然受到消费者的喜爱。披露了添加罗伊氏乳杆菌CGMCC NO.25389制备高活性常温酸奶的新工艺。与添加了其他常规乳酸菌制备的酸奶相比，添加罗伊氏乳杆菌CGMCC NO.25389所制备的酸奶经长期常温保藏后，活菌数更高，酸奶质地更稳定。