本发明涉及一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法，依次按下述步骤进行：（1）将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；（2）加入乙醇，静置反应；（3）离心，取上清；（4）上样至第一层析柱吸附，用超纯水洗脱，收集洗脱液，氮吹干燥；（5）将干燥的洗脱产物复溶，上样至第二层析柱，用0.1‑0.5％TFA的超纯水溶液洗脱，收集洗脱液；（6）将步骤（5）收集的洗脱液通过液质联用进行分析，其中，在液相色谱的过程中进行柱后加液，所添加的试剂为甲酸的甲醇溶液。本发明提供的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，通过对提取工艺以及液相色谱和质谱参数的特定选择，使该方法可以定性母乳中的17种中性低聚糖，并通过精确质谱碎片信息，准确定性测定其中的7种。