本发明涉及一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，依次按下述步骤进行：（1）将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；（2）加入乙醇，静置反应；（3）离心，取上清；（4）利用层析柱吸附，先用超纯水水洗，后用氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液；（5）将洗脱液通过液质联用进行分析。本发明提供的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，通过对提取工艺以及液相色谱和质谱参数的改进，使该方法可以准确的对来源于母乳样品的9种酸性低聚糖进行定性测定，同时，本方法还具备良好的重复性，适用于大规模的母乳样品的分析工作。