本发明涉及基因工程技术领域。本发明提供了一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体及其应用，所述突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列突变得到；所述突变的位点包括第202位、第322位、第372和第548位中的一种或多种。本发明中的黄芪甲苷木糖苷酶突变体通过4个位点的单点突变或组合突变，能够显著提高酶水解黄芪甲苷C3位置木糖苷键的水解活性，相较于野生型黄芪甲苷木糖苷酶，对底物黄芪甲苷的催化活性提高了1～20倍，大幅降低环黄芪醇工业生产的成本，使酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的生产效率显著提高。