本发明公开了一种富含灵芝三萜的灵芝萃取油的制备方法，该方法是先将灵芝细粉和破壁灵芝孢子粉与分别制粒，得到灵芝子实体颗粒和灵芝孢子粉颗粒，再将得到的两种颗粒依次分别干燥，混合后进行二氧化碳超临界萃取，最终使制得的萃取油灵芝三萜含量高于灵芝孢子油中灵芝三萜含量，并具有显著的抗肿瘤的药理活性。