本发明公开了一种口蘑酱油及其制备方法，所述口蘑酱油由按质量份计量的以下组分制成：高盐稀态口蘑酱油原油100份，酵母提取物0.1～1份，5′‑呈味核苷酸二钠0.01～0.5份，白砂糖0.5～5份。制备方法是先将原料发酵制备高盐稀态口蘑酱油原油，然后再用酵母提取物、5′‑呈味核苷酸二钠和白砂糖进行调配，最后灭菌和灌装即得到成品口蘑酱油。本发明避免了现有工艺利用新鲜蘑菇制曲困难、氨基酸态氮生成率不高的缺点，不受口蘑采收季节限制，制备的口蘑酱油，香气浓郁，鲜味突出，营养成分也更丰富，且通过多种辛香料参与发酵达到了不添加味精、不添加防腐剂的目的。