本发明公开了一种固定化胰蛋白酶及其制备方法与应用。本发明采用大孔径聚合物微球为固定化酶载体，将其处理干净，接着活化其功能基团，再与胰蛋白酶溶液混合，振荡反应，酶分子和载体表面的功能基团产生共价结合，静置，然后再调节pH值至9以上，并维持一定时间，制得固定化胰蛋白酶。该制备方法工艺稳定、反应条件温和；制得的固定化胰蛋白酶蛋白固定率可达92.7％；活性回收率高且波动小；在有机溶剂介质中的稳定性获得大幅提高；同时，pH值适用范围更宽，耐酸碱性能更好，固定化酶在pH 2～12的环境中仍能保持很好的活性，应用范围更为广泛。