本发明公开了一种人工设计的青霉素G酰化酶原及其编码序列与应用。本发明通过将野生型青霉素G酰化酶原的底物结合口袋附近的大侧链氨基酸中的一个以上突变为比突变前氨基酸更小的侧链氨基酸，减少底物结合位阻效应，促使底物能迅速进入活性口袋；同时将活性口袋中与底物‑活性中心距离较近的关键亲水性氨基酸或弱疏水性氨基酸中的一个以上突变为疏水性比突变前氨基酸更强的氨基酸，增加底物结合口袋周围的疏水性，减少水分子结合，减少水解，从减少水解和增加合成两方面增加S/H，最终大幅提高青霉素G酰化酶合成阿莫西林的能力。本发明提供了目前为止S/H最高的青霉素G酰化酶原，其在阿莫西林合成中的潜力大。