本发明公开了一种人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法。该人工设计的赖氨酰内切酶是将野生型赖氨酰内切酶中的第167位、第193位和第207位中的至少一个氨基酸进行如下突变得到：第167位的缬氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸；第193位的丝氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸；第207位的甘氨酸突变为缬氨酸或亮氨酸。本发明提供的赖氨酰内切酶酶活高，可达到8000U/L以上，且具有稳定性高的优点。