本发明提供一种柚皮苷对映异构体的分离方法，该分离方法包括：制备供试品溶液；以多糖衍生物类手性色谱柱为固定相，以超临界流体为流动相A、有机溶剂为流动相B，采用超临界色谱法对所述供试品溶液中的柚皮苷对映异构体进行分离。本发明首次将超临界色谱技术应用到柚皮苷对映异构体的分离中来，特别是通过采用合适的超临界色谱条件构建柚皮苷对映异构体分离平台，该分离平台具有普适性，用其进行柚皮苷对映异构体分离时，供试品溶液不限于柚皮苷纯品制备的溶液，还能够适用于从植物或中药提取物中很好的分离柚皮苷对映异构体，能够有效避免植物或中药原料提取物中所含的其他众多化合物群的干扰。