本发明提供了一种人工改造的猪圆环病毒2型Rep′（PCV2 Rep′）蛋白、ELISA检测试剂盒及其应用。该PCV2 Rep′蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；用该PCV2 Rep′蛋白包被ELISA酶标板，构建成能够检测PCV2自然感染猪或PCV2全病毒灭活疫苗免疫猪体内抗体的间接ELISA（iELISA）检测试剂盒。该试剂盒结合PCV2 Cap蛋白抗体iELISA试剂盒一起使用，就能区分自然感染PCV2病毒的猪的血清抗体（或免疫PCV2全病毒灭活疫苗后的猪血清抗体），与接种PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫猪的血清抗体。