本发明提供了一种临床分离副猪嗜血杆菌培养基及分离方法，该培养基由包括如下重量份的原料制成：0.1‑1份对氨基苯甲酸，5‑20份硫酸镁，0.1‑3份NAD，0.1‑5份糖肽类抗生素，1‑10份蜂胶提取物。本发明所述的临床分离副猪嗜血杆菌培养基中添加对氨基苯甲酸和硫酸镁，对氨基苯甲酸能中和磺胺类抗生素，硫酸镁能中和四环素、土霉素、新霉素、多粘菌素、链霉素，提高注射抗生素发病猪副猪嗜血杆菌分离率；添加盐酸万古霉素和替考拉宁糖肽类抗生素与蜂胶提取物，提取物中的多酚类物质与黄酮类物质与糖肽类抗生素结合，可以有效抑制革兰氏阳性菌的生长，提高副猪嗜血杆菌存活率。