本发明公开了一种高纯度多杀菌素的制备方法，属于生物医药提纯技术领域，具体包括如下步骤：首先向多杀菌素粗品中加入有机溶剂，加热溶解后，加入一定量的水，降温过滤得到滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ；然后向步骤（1）得到的滤液Ⅰ中再加入一定量的水，搅拌结晶后过滤、干燥得到高纯度的多杀菌素和滤液Ⅱ，滤液Ⅱ蒸干后得到滤渣Ⅱ与步骤（1）中过滤得到的滤渣Ⅰ以及多杀菌素粗品原料合并，用于下一次制备高纯度多杀菌素的原料。本发明操作简单，多杀菌素收率高，可以达到92%以上，多杀菌素的含量大于97%，其中A组分与D组分的质量比大于4：1。