本发明涉及一种真菌细胞阳性蜡块及其制备方法和应用。所述制备方法，包括培养真菌，将真菌加入液态培养基中培养，待真菌细胞培养达到预定数量后，加入固定剂进行固定并灭活；制作真菌细胞阳性蜡块，在灭活后的溶液中加入对比细胞，混匀后离心，除去上清液得到沉淀物，加入液态琼脂，混匀后冷却凝固，加入固定剂进行固定，脱水、包埋，即得。液态培养基既能给真菌提供营养，又为后续使用琼脂作为介质制作细胞蜡块提供了便捷条件；加入对比细胞能使真菌散落在细胞和细胞团之中，在显微镜下观察真菌效果与检测组织更为接近，同时对比细胞可作为真菌染色的背景衬染，使真菌与背景对比清晰，更容易观察，制作方法简单容易操作，实用性强。