本发明涉及一种17‑羟基孕酮和雄烯二酮的检测方法。该方法包括以下步骤：待测样本溶液的制备：使用自动取样平台将待测血清标本转移至容器中，然后用自动移液平台加入内标工作液并混合，再用自动移液平台加入提取液并混合，离心，用自动移液平台转移上清液至另一容器中并浓缩，浓缩后用自动移液平台加入复溶液并混合，离心，取上清液作为样本待测溶液注入液质联用仪进行平行液相色谱测定和质谱测定。本发明方法首次实现了血清中17‑羟基孕酮及其同分异构体或者结构类似物的分离，抗干扰能力强，结果特异性高，准确度高，通过自动化移液平台进行样本制备，联合平行液相色谱质谱仪应用于样本的检测分析，可将样本制备时间缩短5倍，仪器分析通量提高1倍，并具有样本用量少、线性范围宽等优点。