本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及碱性磷酸酶标记的甲状腺素的制备方法。本发明提供的制备方法将碱性磷酸酶活化后直接与甲状腺素进行连接，不需要对T4进行活化，且不需要偶联BSA等大分子。制得的ALP‑T4复合物具有良好的活性且不含有副产物。并且该制备方法工艺简单，成本低廉。经验证，以该方法制备的ALP‑T4检测游离甲状腺素或总甲状腺素能够具有良好的灵敏度、准确性、精密度和特异性。