本发明提供了一种基于多步固定修饰的酶电极及其制备方法和应用。该酶电极制备方法为：将β‑环糊精溶解于戊二醛的水溶液中，得到溶液A；加入二茂铁和/或二茂铁衍生物混合溶解，得到溶液B；与Nafion溶液混合至沉淀消失后得到透明的溶液C；加入牛血清白蛋白、葡萄糖氧化酶和戊二醛进行充分交联反应，得到溶液D；将溶液D修饰到基底电极的工作电极区域的表面，得到初步修饰的酶电极；将有机高分子聚合物溶液修饰到酶电极工作电极区域的表面，烘干后得到。该酶电极具有很好的稳定性，对葡萄糖具有很好的响应；将其发展成为一种低成本、稳定的持续动态葡萄糖检测的分析方法，对于血糖持续监测和糖尿病的动态分析管理具有重要的意义。