本实用新型提供一种一次性荧光免疫层析检测试剂盒，包括盒体及置于所述盒体内的光源组件和试剂卡，所述试剂卡具有检测窗口和加样孔，其中，所述盒体为柔性遮光材料制成的封闭壳体结构；所述试剂卡设置在所述盒体的底部，所述光源组件产生的光线用于照射所述试剂卡的检测窗口，所述盒体顶部开设有观察视窗和注液孔，所述观察视窗与所述检测窗口相应，所述注液孔与所述加样孔相应。本实用新型的一次性荧光免疫层析检测试剂盒，可实现个人快速自助检测，适于家用及便携检测，使用可靠性好且整体结构紧凑、布局合理，生产成本低，利于大规模生产加工。