本发明公开了一种血液活化凝血时间测定生物传感器及其制作方法。该生物传感器包括依次层叠连接的底层、中间层和上层，中间层设有检测池，底层及上层朝向且对应检测池的表面区域与检测池的池壁配合围成样品检测腔，样品检测腔的上部腔壁以及位于工作电极与参比电极之间的下部腔壁上均设有干燥的凝血促进剂涂层。在凝血反应单元的顶部和底部以及侧壁的凝血促进剂涂层将最大限度的减小聚合物表面的固有变化，并且为精确和一致的活化凝血时间测定提供了均匀的接触表面，在活化凝血时间测定时，待测血液与干燥的凝血促进剂能够充分接触，保持有最大的接触表面，保证血液与凝血促进剂能够充分的混合，进而保证了活化凝血时间测定结果的准确性和可靠性。