本发明提供一种复合酶溶液、酒精检测试纸及其制备方法和应用。所述复合酶溶液包括：酶溶液A、酶溶液B和电子媒介溶液C；所述酶溶液A包括：乙醇氧化酶、山梨酸钾和甘油；所述酶溶液B包括：过氧化物酶、还原剂和电解质盐；所述电子媒介溶液C包括：电子媒介体、多糖、聚甘油脂肪酸脂、木糖醇、烷基酚聚氧乙烯醚、稳定剂和缓冲溶液。所述复合酶溶液能够有效平衡酶的活性和稳定性，由所述复合酶溶液制备得到的酒精检测试纸用于电化学定量检测血液或唾液中的酒精含量，操作方便、快速，灵敏度好，准确性高，稳定性好，且工艺成本较低。