本发明涉及真菌孢子破壁率的测定方法，尤其是灵芝孢子破壁率的测定方法。本发明为一种测定灵芝孢子破壁率的方法，其要点在于取适量同一批次的灵芝未破壁孢子粉A和破壁后孢子粉B，在未破壁孢子粉及破壁孢子粉B分别加入固体分散剂充分混合，用液体溶剂分别稀释上述两种混合物，定容后，混合均匀，在显微镜下观察并计算出单位重量所含完整孢子数量，得出孢子破壁率。本发明的优点在于利用“干物颗粒间的均匀混合”原理，在孢子粉与水混合成悬浮液之前先与固体分散剂进行均匀混合，避免孢子结团以及不能均匀分散的缺陷，达到了计数精确、检测结果具有代表性的目的。