本发明公开了一种显微镜自动对焦方法，特点是包括以下步骤：选取目标物，设定沿显微镜Z轴调节载物台的移动范围和步长，将载物台沿显微镜Z轴调整至初始位置并采集图像；调节载物台沿显微镜Z轴移动一个步长并采集图像，判断载物台是否移动到结束位置，若载物台到达结束位置，则进入下一步骤；若载物台没有到达结束位置，则调节载物台再移动一个步长并采集图像，直到载物台到达结束位置并采集图像；对获得的图像进行计算分别得到每张图像的清晰度并比较获得清晰度最大的图像，其所对应的位置即为对焦位置；调整载物台至对焦位置即完成自动对焦；优点是可以应对各种复杂的切片情况和不同的显微倍率，从而增加清晰度计算的准确性和鲁棒性。