本发明公开一种悬浮培养细胞单克隆筛选培养方法，属于细胞培养技术领域。本发明通过在细胞培养容器内加入明胶溶液预处理，辅助促贴壁培养基，驯化悬浮细胞恢复贴壁特性，待适应贴壁后经有限稀释法进行单克隆培养，再以悬浮驯育培养基进行悬浮培养驯化，完成悬浮培养细胞单克隆筛选培养。本发明方法通过对悬浮细胞恢复贴壁培养特性，有效解决了悬浮细胞单克隆筛选培养的难题，细胞具有悬浮亲源性，大大缩短悬浮培养驯化时间。本发明提供了一种促贴壁培养基和一种悬浮驯育培养基，分别可用于恢复悬浮细胞贴壁特性和辅助细胞悬浮培养驯化。本发明方法可以用于CHO和PK15悬浮细胞的单克隆筛选，是选择优质、高效细胞基质的有效人工筛选途径。