本发明公开了一种高效液相色谱法测定硝酸甘油软膏中有关物质的方法，采用乙腈‑水系统梯度洗脱，通过优化测试条件，不仅可使降解产物1,2‑二硝酸甘油与1,3‑二硝酸甘油色谱峰之间的分离度达到1.5，还可使次级降解产物1‑硝酸甘油与2‑硝酸甘油色谱峰之间的分离度达到1.0，避免了两个次级降解产物（1‑硝酸甘油与2‑硝酸甘油）合并计算成单个杂质的风险。本发明提供的测试方法专属性强，能够精确测量硝酸甘油软膏中的各物质；检测方法灵敏度高，硝酸甘油的检出限为2.1ng；检测方法提高了硝酸甘油软膏有关物质检查的分析准确性，从而可以有效的控制硝酸甘油软膏的质量，具有极强的实用性。