本发明公开了一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法，属于微生物技术领域。该发酵制备得到葡萄糖氧化酶具有高的耐热性和耐酸性，解决了在食品及饲料中因高温及酸性环境中使用导致的酶活力低的缺陷。具体步骤如下：将菌种培养成孢子并将孢子清洗后制备单孢子菌悬液；将单孢子菌悬液接入种子培养基中发酵培养；将种子培养液接入摇瓶发酵培养基中发酵培养，将发酵补充营养液加入发酵液中；糊精、可溶性淀粉及山梨酸钾加入发酵液中并搅拌均匀，将发酵液冷冻，干燥并粉碎，得葡萄糖氧化酶。发酵得到的葡萄糖氧化酶粗酶液经过热处理、硫酸铵‑乙醇复合沉淀及离子交换层析和分子筛凝胶过滤层析，得到高回收率高纯度的葡萄糖氧化酶。