本发明公开了一种稳定的25‑羟基维生素D化学发光免疫检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、试剂R3、试剂R4和试剂R5；其中：R1为包含链霉亲和素磁颗粒的缓冲液，R2为包含化学发光标记物标记的25‑羟基维生素D多克隆抗体和保护剂的缓冲液，R3为包含生物素结合的维生素的小分子抗原衍生物和保护剂的缓冲液，R4和R5为样本预处理试剂，用于解离血清或血浆中以结合蛋白形式存在的25‑羟基维生素D。本发明的试剂盒将酪蛋白胶束作为保护剂添加在试剂缓冲液中，用于检测血清或血浆中25‑羟基维生素D的含量，有效提高了抗原衍生物的稳定性及测试结果的准确性，解决了现有技术中存在的缺陷问题，便于试剂的储存于运输。