本发明公开了一种用于生产天冬酰胺酶的重组里氏木霉及其构建方法和应用，属于生物技术领域，该重组里氏木霉利用同源重组技术将里氏木霉菌株大量分泌表达的蛋白质编码序列替换成天冬酰胺酶蛋白质编码序列，提高天冬酰胺酶的表达量和产品纯度，敲除里氏木霉自身的（半）纤维素酶可提高天冬酰胺酶的产品纯度，敲除里氏木霉自身的蛋白酶可提高天冬酰胺酶的产品稳定性。该重组里氏木霉在天冬酰胺酶表达过程中，通过合适的信号肽的引导作用将天冬酰胺酶蛋白质分泌到胞外，所产的天冬酰胺酶产量高、纯度高、稳定性高，胞外蛋白酶活力低，能有效生产来源于里氏木霉及其他微生物的天冬酰胺酶基因，所生产的天冬酰胺酶，可以应用于食品相关行业。