本发明公开了一种多粘芽孢杆菌的质粒转化方法，该方法通过在寡营养培养基上K+、Ca2+、Mg2+共同刺激多粘芽孢杆菌形成感受态，然后在培养基上完成菌株的质粒转化，与现有的一步转化感受态细胞方法相比，本发明采用的是二步法，即先后将菌体在K‑Ca和K‑Mg诱发下实现转化，能大幅提高转化的成功率和转化效率。另外本发明还能在固体培养基上进行，相较于液体转化而言效率更高，操作更加方便。