本发明公开了一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法，属于微生物发酵技术领域。本发明通过在发酵过程中添加甘氨酸，同时在发酵后期进行降温和溶氧处理，与现有技术相比，不仅增加了短小芽孢杆菌发酵液中的活芽孢数，提升了现有发酵水平，同时又提高了发酵液中代谢产物抗菌肽和生物素IAA的含量，从而增加了发酵产物的药物活性。