本发明公开了一种精酿酱油的制备方法与应用，具体涉及食品生物技术领域，包括如下步骤：（1）将大豆或豆粕经蒸煮处理后与小麦粉混合均匀，得到混合物，冷却至常温，接种曲精，制曲，得到大曲；（2）将步骤（1）所述大曲与盐水混合均匀，在发酵容器内采用高盐稀态酱油酿造方法进行发酵，在发酵的过程中进行负压处理，发酵结束后杀菌灭酶，压榨，过滤取滤液，得到所述精酿酱油。本发明通过在发酵过程中形成负压可有效降低酱油中挥发性盐基氮含量，制备出的酱油的鲜味显著提高，咸味明显降低，整体风味明显提高。