本发明适用汽车检测与诊断设备领域，提供了一种5D四轮定位标定系统，包括：分布在左上、左下、右上、右下和中间方位的五台相机，相机放置在红外灯盘的中心，红外灯盘发射红外光，相机拍摄标靶，标靶反射红外光，标靶放置在标定架上，标靶包括第一标靶、第二标靶和第三标靶。本发明还提供了一种5D四轮定位标定方法，包括：对相机进行焦距调节并固定焦距；对相机进行单相机标定；对相机进行多相机标定，对相机进行侧方相机标定。本发明提供的5D四轮定位标定系统及标定方法，通过采用高精度标靶和工业相机、将相机镜头与标靶硬件搭配、采用多相机标定装置、标定优化算法和标靶的定位定姿，提升了四轮定位检测的标定精度。