本发明公开了一种蟾酥中多种化学成分的含量测定方法，包括确定色谱条件，对照品溶液的制备，供试品溶液的制备和测定法等步骤。该方法可以在同一色谱条件下同时检测蟾酥中八种成分的含量，不仅能有效简化操作步骤，而且显著缩短了测定时间，大大提高了检测效率，有利于实现对蟾酥质量的全面控制。本发明的检测方法灵敏度高，八种成分的色谱峰分离度均大于1.5，且峰型完整，检测方法具有专属性，其准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到科研和生产的要求，适于推广应用。