本发明提供了一种贴壁细胞的细胞微球的制备方法，涉及细胞微球技术领域。本发明所述制备方法通过降低温度、磕碰和补液，可以使孔底的细胞层一侧卷曲，在细胞层张力的作用下，整个孔底的细胞自然卷曲成一点形成细胞微球。通过MTT实验测试细胞微球与同等平面生长干细胞代谢能力的差异，结果显示细胞微球和平面培养的细胞在代谢上没有明显差异。本发明所述制备方法简单，可单次制备大量细胞微球，另外还可以根据培养板孔底的面积调整细胞微球直径的大小。