本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种多重AAV病毒滴度的检测方法。本发明提供一种多重AAV病毒滴度的检测方法，所述多重AAV病毒包括第一腺相关病毒和第二腺相关病毒；所述检测方法包括：根据两者的检测信号强度的比值，基于第一腺相关病毒的滴度获取第二腺相关病毒的滴度。而本发明所提供的多重AAV病毒滴度的检测方法中，通过不同腺相关病毒中的滴度校准片段，所述第一滴度校准片段与第二滴度校准片段可以具有相同的多核苷酸序列，能够实现多个腺相关病毒的用量和比例的准确调整和优化，提高了外源序列的拼接效率，继而最大化实现目的基因的表达。