本发明公开一种遗传性耳聋相关基因检测芯片试剂盒，该试剂盒包括检测遗传性耳聋三个热点基因上20个位点变异的特异性探针和引物，所述20个位点包括：GJB2上5种突变型、SLC26A4上12种突变型以及12S rRNA（MTRNR1，属于线粒体基因）上3种突变型，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:40所示，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO:41～SEQ ID NO:60所示。本发明还公开了具体的检测方法。本发明的试剂盒是特别针对中国南方人群的遗传性耳聋基因的热点突变位点而设计，能提高针对中国南方人群的遗传性耳聋检测的准确率，克服了现有的试剂盒主要针对中国北方人群位点设计，对于南方人群的检测易造成漏检的缺陷。