本发明公开了一种基于二代测序的微卫星不稳定性检测方法，包括如下步骤：（1）将不同MSI阴性样本测序数据合并，获得参考集；（2）统计参考集中MSI位点i的深度Di；（3）计算MSI阴性样本的MSI位点i的微卫星序列的数据特征Fi；（4）统计整个所述参考集中低于阈值a的MSI位点i的深度Di的个数，然后选择构建混合参考集；（5）对MSI阴性样本进行分组质控；（6）进行第一次检出；（7）若上述第一次检出中被判为MSS候选位点的位点j的个数少于d，则该第一次检出的结果即为最终的检出结果；否则需要进行第二次检出，获得最终的检出结果；（8）对于步骤（7）所获得的待测样本中被判定为MSI候选位点的位点j的个数占该待测样本的总位点数的比例，判断待测样本的微卫星稳定状态。