本发明公开了一种利用胶体金免疫层析技术定量检测血清胃蛋白酶原的试纸条及其制备方法和应用。本发明的试剂盒包括分别用于胃蛋白酶原I以及用于胃蛋白酶原Ⅱ检测的试纸条，所述的试纸条按照连接顺序依次包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫，还包括位于下方的塑料底衬，其中塑料底衬的作用是提供组装平台，硝酸纤维素膜上具有胃蛋白酶原I或Ⅱ喷涂的质控线，以及胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原Ⅱ的二抗喷涂的检测线，金标垫上涂覆有胶体金颗粒标记的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原Ⅱ的单克隆抗体，样品垫提供了待测样品加入的位置。本发明试剂盒可以直接定量检测胃蛋白酶原，不需专业培训，操作方便，快速，适合在基层医院和体检中心推广和运用。