本发明提出耐生物燃油的低渗透汽车加油口软管及其制备方法，包括从内至外依次设置的内管层、中管层和外管层；制成所述内管层的橡胶组合物包括以下重量份的原料氢化丁腈生胶100份，N550炭黑50‑90份，白炭黑5‑10份，防老剂445 1‑4份，氧化镁10‑40份，不溶性硫磺0.5‑1.5份，硫化剂双‑25 2‑10份，促进剂CZ 1‑4份，促进剂PZ 0.5‑1.5份，防焦剂CTP 0.2‑1.5份，粘合剂DC‑100 0.5‑5份；所述中管层由氟树脂CPT制成；制成所述外管层的组合物包括以下重量份的原料：丁腈PVC 100份，N660炭黑50‑110份，白炭黑5‑20份，防老剂RD 1‑4份,防老剂4010NA 1‑3份，氧化锌3‑10份，不溶性硫磺0.5‑2份，促进剂DM 0.5‑2.5份，促进剂TBzTD 1‑3份，粘合剂DC‑100 0.5‑5份。该软管具有优于现有汽车加油口软管的抗腐蚀性、抗渗透性和耐热性，能够适应生物燃油的使用要求。