本发明公开了检测链特异性效率的成套试剂与方法。本发明公开的检测链特异性效率的成套试剂由SEQ ID NO:1‑6所示的RNA组成，检测链特异性效率的方法，包括：向待建库的RNA中添加本发明的成套试剂，后进行链特异性转录组文库构建，然后进行高通量测序，将测序数据与成套试剂的序列进行比对，计算成套试剂的正义比对读段数目占成套试剂的总读段数目的比例，该比例即为链特异性系数，根据链特异性系数确定链特异性效率。本发明的检测链特异性效率的方法与成套试剂可以用于指示mRNA或非编码RNA等链特异性转录组测序数据的可信程度，确保分析结果的可靠性。