本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及无血清培养基及其制备方法和间充质干细胞的培养方法。该培养基由如下成分组成：非必需氨基酸、谷氨酰胺、氢化可的松、地塞米松、聚乙烯醇、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人Wnt‑3a蛋白、重组人纤连蛋白、重组人层黏蛋白、L‑谷胱甘肽、L‑抗坏血酸、β‑巯基乙醇、乙醇胺、Pluronic F‑68、Tween 80、胆固醇、腺嘌呤、亚硒酸钠、基础培养基。本发明发现聚乙烯醇可替代无血清培养基中血清白蛋白的载体作用，有效提高间充质干细胞的增殖能力，其性能比血清白蛋白更稳定，可有效解决干细胞增殖与传代能力下降的问题。