本发明属于干细胞领域，公开了一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法，取皮肤组织预处理后，加Dispase II分散酶消化，清洗后反复吹打组织块使其细胞分离，过滤后离心，得到细胞沉淀用Lonza完全培养基重悬后接种于培养皿中培养60‑90min；取未贴壁的细胞悬液接种至纤黏连蛋白包被的培养板中培养，待细胞汇合达到80％～90％后进行传代。利用本发明所述原代分离方法分离培养的皮肤间充质干细胞细胞膜不会受到伤害，细胞培养稳定，且不会引入支原体污染，可分离出大量皮肤间充质干细胞，且细胞活力好，能够后续稳定培养。