本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一重组人源Ⅲ型胶原蛋白及其应用。本发明对人全长Ⅲ型胶原蛋白进行优化，选取一段含有123个氨基酸序列区段，并将该区段序列中三肽序列Gly‑Pro‑Hyp定向替换为Gly‑Pro‑Arg序列，并对其进行4重复，同时在‑C末端连接GPPGPCCGGG序列，该重组蛋白具有三级螺旋结构，显现出更强的稳定性，且具有接近天然胶原的性质。所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白可以在毕赤酵母中有效稳定和大量表达，同时C端连接6个组氨酸特异性亲和纯化标签，易于获得高纯度产品，能够适应于工业化的大规模生产。