一种细胞角蛋白19片段抗原及其制备方法和应用，其特征在于：所述的CYFRA21‑1抗原是由体外培养的肺癌细胞系通过小分子激活剂处理后引起细胞程序性凋亡，并释放CYFRA21‑1抗原。本发明的优点在于小分子激活剂PAC‑1可在短期内激活半胱天冬酶‑3酶原，酶解细胞角蛋白19，促使体外培养的肺癌细胞系按照程序性凋亡的方式制备CYFRA21‑1蛋白，该方法制备的蛋白是人体天然蛋白，用作试剂盒校准品性能稳定、抗原抗体亲和力高。该方法制备的抗原稳定性良好，抗原制备周期短，抗原得率高，抗原粗提纯后可用于CYFRA21‑1检测试剂盒校准品。