本发明涉及一种蛋白错配二硫键的分析方法，其步骤包括：制备测试组样品；制备鉴别组样品；对鉴别组样品和测试组样品进行肽质量指纹谱图分析。本发明的方法可以用于检测蛋白药物中的错配二硫键杂质组分，解决了现有二硫键分析方法中仅关注正确配对二硫键而忽视错误配对二硫键的不足，对于提高蛋白药物的结构表征分析水平、保障生物药物的安全性及有效性具有较大的实用价值。