本发明涉及到免疫层析检测技术领域，尤其是涉及到一种25‑羟基维生素D解离液、检测方法、应用及试剂盒。所述25‑羟基维生素D解离液，包括4‑8份盐酸胍和2‑4份碳酸丙烯酯，其pH为7.0~9.0。在25‑羟基维生素D解离过程中，盐酸胍通过形成和解离蛋白结构中的肽键使得VDBP蛋白发生随机卷曲，使得蛋白质失去其活性结构，发生可逆性变性。而碳酸丙烯酯的极性结构使得肽键解离之后的各部分氨基酸残基发生松散现象，使得盐酸胍的解离效果更加充分，解离所需时间更短。二者协同作用，提高解离效率。本发明提供的检测试剂盒，操作简单、价格更加低廉，与酶联免疫法相比灵敏度和特异性更高。