本发明提供了一种酶试剂的制备方法，具体包括：在第一缓冲液中加入合成磷脂，得到混合液；在混合液中加入组织因子得到组织因子溶液；对组织因子溶液进行处理得到组织因子酯化物；将组织因子酯化物加入到第一缓冲液中进行处理得到酯化凝血因子；将硫酸亚铁、矢车菊色素溶解在第一缓冲液中，取上层清液，得到亚铁‑矢车菊螯合物的电子介体；调节亚铁‑矢车菊螯合物的电子介体的pH，并在此基础上制备酶试剂母液；以酶试剂母液为溶剂，混合酯化凝血因子得到酶试剂。本发明还提供了一种凝血酶原时间检测卡，所述检测卡上含有上述制备方法制得的酶试剂。本发明的优点在于，所述酶试剂能够被应用于凝血酶原时间检测中，提高凝血酶原时间检测的灵敏度。